近日，威尼斯欢乐娱人城精品生物与合作单位华中农业大学农业微生物学国家重点实验室在Journal of Applied Microbiology上发表了题为“Transcriptome analysis reveals the underlying mechanism for over-accumulation of alkaline protease in Bacillus licheniformis”的研究成果。该研究基于GenoLab M高通量基因测序仪完成了碱性蛋白酶的高产菌株Bacillus licheniformis AQ在50 L发酵罐全过程（8个时间段）的转录组测序以解析其高表达碱性蛋白酶机制。在发酵终点（48 h)时，碱性蛋白酶达到峰值（42,020 U/mL），其他时间点与这个时间点比较，得到各组差异表达基因。随后取其各组差异表达基因的交集，得到61个基因，对它们的功能分析发现：这些基因的编码蛋白主要参与了分解代谢过程、肽酶和抑制剂、伴侣和折叠催化等过程。
碱性蛋白酶(AprE)是一种重要的工业酶，广泛应用于食品加工、洗涤剂工业、皮革业、生物转化反应、废物处理、生物活性肽合成等领域。在全球范围内，AprE占据了50%以上的酶产业。然而，目前的AprE产量仍然不能满足工业需求，导致了大规模工业酶短缺。因此，进一步提高AprE产率具有广阔的工业应用前景。很多微生物都能合成AprE，而其中芽孢杆菌属Bacillus具有明显优势，它们属于公认安全菌株，其蛋白分泌能力强，易于培养，发酵周期短，工业发酵稳健性强，基因修饰方便，例如B. licheniformis，可以敲除调控因子sig F，阻止芽孢形成，使得AprE的酶活提升20%，达到29,494 ± 1053 U/mL。安琪酵母股份有限公司拥有一株高产AprE的菌株，B. licheniformis AQ，本次采集了50 L大罐发酵的8个重要时间点样本测定了AprE的酶活等理化指标，并提取RNA完成转录组测序。
01 AprE发酵过程中的基因表达模式
该研究的8份样本转录组测序，一共得到242 M高质量reads，检测到3821个基因在发酵过程中表达，占菌株总基因的91.74%。显然，发酵终点(48 h)时高表达基因最多(a)。由于AprE酶活在发酵终点(48 h)时最高，因此，以48 h作为对照，进行差异表达基因（DEG）分析，24 h时DEG数目最多，其次是32 h(b)。七个比较组的DEG的交集一共涉及61个基因(c)。通过功能富集分析发现这61个基因主要参与生物过程，尤其是氨基酸、α -氨基酸、有机酸、有机氮化合物等众多分解代谢过程(d)。而肽酶和抑制剂、伴侣蛋白和折叠催化(KEGG)和胞外区域(GO_Cellular component)等功能富集最为显著。DEG中最多的功能是肽酶和抑制剂。高效的蛋白分泌和折叠是芽孢杆菌重组蛋白生产的关键。这些过程由转运系统的组分以及细胞内和胞质外的伴侣蛋白辅助完成。这部分富集分析结果也证实了在AprE发酵过程中分泌和折叠活性非常活跃。
02 AprE发酵过程中的潜在调控网络
研究人员查阅文献，并结合转录组测序结果，一共挑选了30个蛋白，它们可能与AprE合成相关，通过与STRING数据库进行分析，绘制PPI（蛋白相互作用）网络，最终得到了22个蛋白的网络信息。Spo0A位于中心，拥有节点数最多(11个)，其次是CodY (9个)、sigH (9个)和ArbB (8个)。而这些蛋白的编码基因表达量热图显示，AprE基因的表达量在24 h达到峰值，随后下降，在32 h达到第二高峰，随后下降，发酵结束时略有上升。右下5个sigma因子的表达模式与AprE略有不同。
03 qRT-PCR验证转录组表达量
研究人员挑选了与AprE合成相关的20个关键基因进行qRT-PCR验证，包括芽孢形成的16个调控基因，4个全局调控基因。qRT-PCR数据显示：大多数基因在32 h时表达水平较高。而转录组数据显示大部分基因在24 h时表达水平较高，但未检测到qRT-PCR数据。虽然qRT-PCR与RNA-seq数据存在一定差异，但大部分基因的表达趋势是一致的，证明了转录组数据的可靠性。
1. 该研究首先考察了B. licheniformis AQ在工业发酵过程中不同时间点碱性蛋白酶的变化。结果表明，发酵过程中碱性蛋白酶不断积累，在发酵48 h时达到最大值；
2. 发酵全过程的转录组测序结果显示：表达量最高的基因在发酵结束时(48 h)最多；
3. 构建了潜在的PPI网络，并利用qRT-PCR技术对AprE发酵过程中关键基因的表达水平进行了验证。
Ji A, Zheng X, Yang W, et al. Transcriptome analysis reveals the underlying mechanism for over-accumulation of alkaline protease in Bacillus licheniformis[J]. Journal of Applied Microbiology, 2023: lxad319.